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在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片段，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，简称RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。
迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2（AGO2）的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶（RNA helicase）也被鉴定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1，这是一种RdRP（RNA-dependent RNA Polymerase），植物中也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA（或siRNA）作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。
在真核生物当中，还存在另外一种小分子RNA（microRNA）也能引起RNA干扰现象。microRNA大多20-22nt长，前体具有类似发夹性的茎环结构。microRNA产生于该茎环结构的双链区。其特点与siRNA基本上相同。
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